StarPure无内毒素质粒小提试剂盒(膜柱法)

产品简介：

本试剂盒采用新型硅基质膜技术，配合优化的缓冲体系可让质粒DNA 高效专一的结合到膜上，同时采用特殊的缓冲液系统和除内毒素过滤柱，有效去除内毒素、蛋白等杂质。
每个吸附柱最高可吸附40 μg的质粒DNA。本试剂盒适用于提取1-5 mL菌液，提取的质粒纯度高、质量稳定，特别适用于细胞转染，同时也可用于DNA测序，PCR，基于PCR
的突变，体外转录，转化细菌，内切酶消化等下游实验。

产品组分：

实验前准备：

自备试剂：

异丙醇（Isopropanol）、75% 乙醇（Ethanol）。

注意事项：

1. 加入RNase A的Buffer P1 置于2-8℃可稳定保存6个月。
2. 第一次使用前，将RNase A溶液全部加入到ResuspensionBuffer P1中，混匀，置于2–8℃保存，使用前需在室温中放置一段时间，恢复至室温后使用。
3. 第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer PW中加入无水乙醇。
4. 使用前请先检查LysisBuffer P2 和Extraction Buffer E3是否出现结晶或沉淀，如有结晶或沉淀现象，可在37℃水浴几分钟，即可恢复澄清。
5. 注意不要直接接触LysisBuffer P2和Extraction Buffer E3，使用后应立即盖紧盖子。
6. 提取质粒的量和纯度与细菌培养浓度、菌株种类、质粒大小、质粒拷贝数等因素有关。

操作步骤：

1. 取1~5 mL细菌培养液置于离心管中，放入离心机于12000 rpm 离心2min或4000 rpm离心10 min，彻底弃去上清液。
2. 将离心管从离心机中取出，加入250 μLResuspension Buffer P1（请先检查是否已加入RNase A），涡旋混匀至沉淀完全悬浮，溶液呈白色浑浊。

注意：如果菌块未彻底混匀，将会影响裂解效果，使提取量和纯度偏低。

1. 加入250 μL Lysis BufferP2，上下翻转颠倒8-10次，不要涡旋混匀，放置3-5 min，此时溶液应变得清亮粘稠。（可观察破碎状态，若菌液浓度太高，可延长裂解时间至最长10 min）。
2. 加入250 μLExtraction Buffer P3，上下翻转颠倒8-10次，此时出现白色絮状沉淀，室温放置5 min。
3. 4℃12000 rpm离心5-10 min或4000 rpm离心20 min，吸取上清，将上清液（约550 μL）加入内毒素过滤柱中（过滤柱放置在收集管中），注意尽量避开上清液中可能残留的少量浮沫
     (浮沫过多可再次离心去除)，12000 rpm 离心1 min，滤液收集在离心管（自备）中。
4. 加入3倍上清体积的异丙醇，上下颠倒混匀。
5. 柱平衡：向已装入收集管的DNA吸附柱中加入200μL Buffer PS，12,000 rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
6. 将步骤6中滤液与异丙醇的混合溶液转移到平衡好的吸附柱（已装入收集管）中。
7. 12,000 rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
      注意：吸附柱的最大容积为750 μL，如果样品体积大于750 μL可分批加入。
8. 向吸附柱中加入750 μL Buffer PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心 1min，倒掉收集管中的废液。
9. 将吸附柱重新放回收集管中，12,000 rpm离心1min。 注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR等）。
10. 将吸附柱置于一个新的收集管中，向吸附膜的中间部位加入50-100μL Endo-Free Buffer EB，室温放置2-5分钟，12,000 rpm离心2 min，将质粒溶液收集到离心管中。-20℃保存质粒。

注意：

1）为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，室温放置2-5分钟，12,000 rpm离心2 min，将质粒溶液收集到离心管中。

2）对于地拷贝质粒或质粒大小>10 kb时，可将Endo-Free Buffer EB在65-70℃水浴预热，可以增加提取效率。